Der Nachtbetrieb findet an Wochenenden und vor Feiertagen statt. Zusätzlich zu den fünf U-Bahn-Linien verkehren 17 Nachtbuslinien und sieben ASTAX-Linien. Das Intervall der U-Bahnen wird in der Nacht 15 Minuten betragen, die Nachtbusse werden weiterhin im 30-Minuten-Takt verkehren. Das Nachtbusnetz unter der Woche bleibt unverändert.

Insgesamt werden im Nachtbetrieb 22 U-Bahn-Garnituren und 40 Nachtbusse die Fahrgäste quer durch Wien bewegen. Die Wiener Linien erwarten an den Wochenenden über 30.000 Fahrgäste im neuen Nachtnetz. Die Nachtbuslinien werden an die U-Bahn herangeführt und ermöglichen dort die Weiterfahrt abseits der U-Bahn-Strecken.

„Mit einem genau abgestimmten Fahrplan von U-Bahn und Nachtbussen versorgen wir dann 96 Prozent der Wiener Bevölkerung und verbessern die Mobilität in den Nachtstunden am Wochenende deutlich", sagte Wiener Linien-Geschäftsführer Günter Steinbauer.

Für die Wiener Nachtschwärmer wird es am 3. September eine Event-Nacht mit über 35 teilnehmenden Locations geben. Für alle Locations des „Nightride" wird es ein kostenloses Ticket geben, das zugleich für die Öffis gültig sein wird. Ab 3. August kann das Ticket über www.24stundenwien.at ausgedruckt werden.

Zu den Eckpunkten der Vorbereitungen für die Nacht-U-Bahn gehört ein umfassendes Sicherheitskonzept. Polizeibeamte und MitarbeiterInnen der Wiener Linien werden gemeinsam für Sicherheit und Ordnung in den U-Bahn-Zügen sorgen.

Bei der von Bürgermeister Michael Häupl initiierten Volksbefragung im Februar 2010 entschieden sich 54 Prozent der Wienerinnen und Wiener für die Einführung der 24-Stunden-U-Bahn.